Logowanie

Jak działa moduł LOD/LOQ?

Po co w ogóle liczyć LOD i LOQ?

LOD (Limit of Detection, granica wykrywalności) to najmniejsza ilość/stężenie analitu, które metoda jest w stanie odróżnić od sygnału tła, z rozsądną pewnością.
LOQ (Limit of Quantification, granica oznaczalności) to próg wyżej, od którego wynik można nie tylko wykryć, ale też podać jako liczbę, której wielkości ufamy (na tyle powtarzalną i precyzyjną, żeby się na niej opierać).
Poniżej LOD nie da się wiarygodnie stwierdzić, czy analit w ogóle jest obecny; między LOD a LOQ wiemy, że znajduje się w próbce, ale nie ufamy dokładnej wartości; powyżej LOQ wynik można traktować jako pełnoprawny wynik ilościowy.

Należy pamiętać, że LOD i LOQ nie są cechami samej metody, tylko kombinacji metody + matrycy + procedury przygotowania próbki — w różnych warunkach te same procedury mogą dawać różne LOD/LOQ. Pewność uzyskanych poziomów LOD/LOQ uzyskamy dopiero przy ich potwierdzeniu w praktyce: w procesie walidacji/weryfikacji, potwierdzenia dolnego poziomu w próbkach rzeczywistych, w różnych seriach pomiarowych i przy różnych operatorach.

Kolory stref na wykresach

Każda metoda w tym module rysuje wynik na tej samej osi kolorów:
czerwona strefa — poniżej LOD, wynik nieodróżnialny od tła;
żółta strefa — między LOD a LOQ, analit wykryty, ale liczba niepewna;
zielona strefa — powyżej LOQ, wynik można traktować ilościowo.
Wyjątkiem jest metoda 5 (ISO 11843) — tam zielona strefa oznacza tylko „powyżej granicy wykrywalności (CCβ)”, norma ta w ogóle nie wyznacza LOQ, więc nie należy z niej odczytywać, od kiedy wynik jest wiarygodny ilościowo (do tego służą inne metody z tego modułu, np. profil precyzji).

1. Odchylenie standardowe próby ślepej

Najprostsze podejście: ze zmierzonej wielokrotnie samej próby ślepej (bez analitu) i obliczane jest odchylenie standardowe jej sygnału. Im mniejszy „szum” tła, tym niższy LOD. Dobrze sprawdza się, gdy sygnał tła jest łatwo mierzalny (spektrofotometria, AAS, ICP, elektrochemia). Wymaga stosunkowo dużej liczby powtórzeń (10–20), żeby oszacowanie odchylenia standardowego było stabilne — przy zbyt małej próbie wynik może się mocno wahać między kolejnymi seriami pomiarowymi.

L_c, LOD i LOQ tej metody to sygnał ponad średnią próby ślepej. Raport podaje też odpowiadający im wynik pomiaru (średnia próby ślepej + granica).
„Wynik do oceny” wpisz tak, jak odczytano go z przyrządu – program sam odejmie średnią próby ślepej.

2. Odchylenie standardowe i nachylenie krzywej kalibracyjnej

Rozszerzenie metody 1 o krzywą kalibracyjną: zamiast patrzeć tylko na szum tła, uwzględniamy też, jak stromo rośnie sygnał wraz ze stężeniem (nachylenie). Im bardziej stroma krzywa przy tym samym szumie, tym niższy LOD/LOQ — metoda „widzi” mniejsze zmiany stężenia. Odchylenie standardowe można policzyć trzema sposobami: z próby ślepej (jak w metodzie 1), z odchylenia resztowego samej regresji, albo z niepewności standardowej wyrazu wolnego (intercept) tej samej regresji — trzecia opcja, dopuszczona wprost przez ICH Q2(R2), nie wymaga osobnego pomiaru próby ślepej.

Gdy na poziomach krzywej są powtórzenia, nie są one niezależnymi punktami krzywej (pochodzą z tego samego roztworu wzorcowego). Rozrzut wyników jest wtedy rozdzielany na powtarzalność w poziomie (σ_r) i rozrzut średnich poziomów wokół krzywej (τ): odchylenie resztowe to odchylenie pojedynczego pomiaru wokół krzywej, √(τ² + σ_r²), a niepewność wyrazu wolnego liczona jest ze średnich poziomów.

Uwaga przy wyborze SD wyrazu wolnego: domyślny mnożnik LOD to wtedy 6 (nie 3,3) — bardziej konserwatywna, również udokumentowana w literaturze konwencja; mnożnik LOQ pozostaje 10. Oba mnożniki (dla dowolnego źródła σ) można w formularzu samodzielnie zmienić. Pełne wyprowadzenie, uzasadnienie i bibliografia — w osobnym dokumencie technicznym dołączanym do raportu PDF tej metody.

3. Stosunek sygnału do szumu (S/N)

Metoda „szybka” — potrzebujesz tylko jednego pomiaru próbki o niskim, znanym stężeniu, z czytelnym sygnałem i szumem tła w sąsiedztwie retencji analitu. LOD to stężenie odpowiadające S/N = 3, a LOQ — S/N = 10. Typowa dla chromatografii (HPLC, GC), gdzie oprogramowanie producenta odczytuje S/N automatycznie.

4. Profil precyzji (CV w funkcji stężenia)

Zamiast patrzeć na szum tła, ta metoda pyta wprost: „na którym poziomie stężenia powtarzalność wyniku (CV, współczynnik zmienności) przestaje być akceptowalna?”. Mierzone jest wiele powtórzeń na kilku poziomach stężenia, po czym sprawdza się, gdzie CV przekracza wybrany próg — to LOQ. Najczęściej stosowana w bioanalityce i diagnostyce klinicznej, gdzie kryteria precyzji są zwykle wprost zdefiniowane w procedurze. Próg CV można ustawić globalnie dla wszystkich poziomów albo dla każdego poziomu z osobna — bywa to potrzebne, bo precyzja nie musi być jednakowa na całym zakresie krzywej.

5. ISO 11843-2 (zdolność wykrywania)

Najbardziej sformalizowane podejście, oparte na pełnym układzie kalibracyjnym z niezależnymi preparatykami (nie tylko powtórzeniami pomiaru tej samej preparatyki) na kilku poziomach stężenia. Metoda jawnie uwzględnia dwa rodzaje ryzyka: α (ryzyko fałszywego wykrycia analitu, którego nie ma) i β (ryzyko przeoczenia analitu, który jest obecny) — stąd dwa progi normy: krytyczna wartość CCα i granica wykrywalności CCβ. Stosowana głównie tam, gdzie wymagane jest formalne odniesienie do normy (akredytacja, metody urzędowe).

Wzory normy mają sens tylko dla krzywej rosnącej, której nachylenie istotnie różni się od zera (test t na wybranym poziomie istotności α). Gdy odpowiedź nie zależy od stężenia albo maleje, wykonanie obliczeń nie jest możliwe — warto wtedy sprawdzić dane i zakres stężeń poziomów.

Którą metodę wybrać?

Nie ma jednej „poprawnej” metody dla każdej sytuacji — wybór zależy głównie od tego, jakie dane laboratorium ma zebrane oraz jakiego formalnego uzasadnienia wymaga procedura/norma.
Jeżeli użytkownik posiada tylko serię pomiarów próby ślepej — metoda 1.
Jeżeli dysponuje krzywą kalibracyjną — metoda 2 (dokładniejsza niż metoda 1, bo uwzględnia nachylenie).
Jeżeli potrzeba szybkiego, orientacyjnego oszacowania z pojedynczego chromatogramu — metoda 3.
Jeżeli kluczowe jest kryterium precyzji (typowo bioanalityka) — metoda 4.
Jeżeli procedura wymaga formalnej, normowej oceny α/β — metoda 5.

W wielu laboratoriach warto policzyć więcej niż jedną metodę na tych samych/pokrewnych danych i porównać wyniki — rozbieżne oszacowania LOD/LOQ same w sobie są cenną informacją o tym, jak stabilna jest granica wykrywalności danej procedury.

Źródła

Currie, L.A. (1995), Nomenclature in evaluation of analytical methods… (IUPAC Recommendations 1995), Pure Appl. Chem. 67(10), 1699–1723.
ICH Q2(R2) (2023), Validation of Analytical Procedures.
ICH M10 (2022), Bioanalytical Method Validation.
Mocak, J., Bond, A.M., Mitchell, S., Scollary, G. (1997), A statistical overview of standard (IUPAC and ACS) and new procedures for determining the limits of detection and quantification, Pure Appl. Chem. 69(2), 297–328 (alternatywne mnożniki LOD/LOQ dla metody 2).
CLSI EP17-A2, Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures.
ISO 11843-2:2000, Capability of detection — Part 2: Methodology in the linear calibration case.
PN-EN 482, Procedury oznaczania stężeń substancji chemicznych w powietrzu na stanowiskach pracy — wymagania podstawowe dotyczące charakterystyki metod pomiarowych.